کروماتوگرافی ستون آبگریز

کروماتوگرافی تعامل آبگریز(HIC) یک تکنیک قدرتمند است که عمدتاً در جداسازی و تصفیه پروتئین ها ، به ویژه آنهایی که دارای خواص آبگریز هستند ، استفاده می شود. این روش کروماتوگرافی از فعل و انفعالات هیدروفوبیک دیفرانسیل بین مولکول های نمونه و مرحله ثابت استفاده می کند ، و امکان جداسازی اجزای را بر اساس سرعت مهاجرت آنها در هنگام شستشو با فاز متحرک فراهم می کند. در این مقاله جامع ، ما به اصول ، بهره برداری ، برنامه ها ، مزایا ، مضرات و پیشرفت های اخیر کروماتوگرافی تعامل آبگریز می پردازیم.

پایه و اساس HIC در فعل و انفعالات آبگریز بین مولکول های پروتئین و لیگاند های آبگریز متصل به مرحله ثابت قرار دارد. پروتئین ها ، که از نظر طبیعت آمفیپاتی هستند ، حاوی باقیمانده های آبگریز و آبگریز هستند. در محلول های آبی ، باقیمانده های آبگریز تمایل به روبرو شدن به بیرون ، در تعامل با مولکول های آب ، در حالی که باقیمانده های آبگریز اغلب در ساختار سوم پروتئین دفن می شوند. با این حال ، در شرایط خاص ، مانند وجود غلظت نمک بالا ، این باقیمانده های آبگریز می توانند در معرض دید قرار بگیرند و تعامل آنها با لیگاند های آبگریز بر روی ماتریس کروماتوگرافی را ترویج می کنند.

فاز موبایل در HIC به طور معمول از یک محلول شور بافر با دامنه pH {0}} تشکیل شده است. غلظت نمک بالا برای تقویت فعل و انفعالات آبگریز استفاده می شود و اتصال پروتئین ها به مرحله ثابت را تسهیل می کند. کاهش تدریجی غلظت نمک در فاز متحرک در هنگام شستشو باعث افزایش قدرت شستشو می شود و باعث می شود پروتئین ها بر اساس آبگریز بودن آنها شسته شوند. پروتئین هایی با فعل و انفعالات آبگریز ضعیف تر ابتدا شسته می شوند و به دنبال آن کسانی که دارای تعامل قوی تر هستند.

روش کروماتوگرافی ستون آبگریز شامل چندین مرحله مهم از جمله تهیه نمونه ، تعادل ستون ، بارگیری نمونه ، شستشو و جمع آوری کسری است.

◆ آماده سازی نمونه:
قبل از بارگیری نمونه بر روی ستون ، تهیه نمونه با اضافه کردن نمک کافی برای مطابقت با غلظت نمک فاز متحرک A (بافر تعادل) بسیار مهم است. pH محلول نمونه نیز باید تنظیم شود تا شرایط جذب را برآورده کند.

◆ تعادل ستون:
این ستون با فاز متحرک A تعادل می یابد ، که یک محلول نمکی بافر از یک pH خاص و غلظت نمک است. این تضمین می کند که فاز ثابت با بافر اشباع شده است ، آماده تعامل با پروتئین های نمونه است.

◆ بارگیری نمونه:
نمونه آماده شده بر روی ستون بارگذاری می شود. حجم نمونه تحت تأثیر غلظت مؤلفه و ظرفیت اتصال رسانه است. برای نمونه های رقیق شده ، بارگذاری مستقیم بدون غلظت قبلی امکان پذیر است.

◆ شستشو:
شستشو با کاهش تدریجی غلظت نمک فاز متحرک حاصل می شود و در نتیجه تضعیف فعل و انفعالات آبگریز بین پروتئین ها و مرحله ثابت می شود. از طرف دیگر ، با افزودن حلال های آلی یا مواد شوینده به فاز موبایل ، می توان شستشو را برای تغییر قطبیت آن یا جابجایی پروتئین های محدود به دست آورد.

◆ مجموعه کسری:
کسری های شسته شده برای ارزیابی خلوص و بازیابی پروتئین های هدف جمع آوری و مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرند.

چندین عامل به طور قابل توجهی بر راندمان جداسازی و خلوص پروتئین ها در کروماتوگرافی ستون آبگریز تأثیر می گذارد:

◆ غلظت و نوع نمک:
نوع و غلظت نمک در فاز متحرک نقش مهمی در تعدیل فعل و انفعالات آبگریز دارد. نمک هایی مانند سولفات آمونیوم و کلرید سدیم معمولاً استفاده می شود ، با غلظت های مختلف از {0}} 75 تا 2 مول در لیتر برای سولفات آمونیوم و 1 تا 4 مول در لیتر برای کلرید سدیم.

pH:
pH فاز متحرک بر وضعیت بار و آبگریز پروتئین تأثیر می گذارد. pH به دور از نقطه ایزوالکتریک پروتئین با کاهش تعامل آبگریز تمایل به شستشو دارد.

◆ درجه حرارت:
افزایش دمای ستون می تواند فعل و انفعالات آبگریز را تقویت کند و منجر به بهبود راندمان جداسازی شود.

◆ سرعت جریان:
سرعت جریان بر زمان اقامت پروتئین ها در ستون تأثیر می گذارد و بر تعامل آنها با فاز ثابت تأثیر می گذارد.

◆ مشخصات ستون:
طول ، قطر و مواد بسته بندی ستون همه به راندمان جداسازی کمک می کنند. انتخاب مواد فاز ثابت و خصوصیات سطح آن نیز بسیار مهم است.

HIC کاربرد گسترده ای را در تصفیه پروتئین های مختلف ، از جمله پروتئین های سرم ، پروتئین های وابسته به غشای ، پروتئین های هسته ای ، گیرنده ها و پروتئین های نوترکیب پیدا می کند. شرایط جداسازی ملایم آن ، آن را به ویژه برای تصفیه مواد فعال مانند آنزیم ها ، آنتی بادی ها و سایر پروتئین های درمانی مناسب می کند.

مزایا:

1) نرخ بازیابی بالا: HIC نرخ بازیابی بالایی از پروتئین ها را ارائه می دهد و آن را برای فرآیندهای تصفیه در مقیاس بزرگ کارآمد می کند.

2) فعالیت پروتئین حفظ شده: شرایط جداسازی خفیف دناتوراسیون پروتئین و از بین رفتن فعالیت را به حداقل می رساند.

3) تطبیق پذیری: HIC می تواند برای تصفیه طیف گسترده ای از پروتئین ها با خواص مختلف آبگریز سازگار شود.

معایب:

1) حلالیت محدود: برخی از پروتئین ها ممکن است در غلظت های نمک بالا حلالیت کاهش یافته و کاربرد آنها را در HIC محدود کنند.

2) تداخل نمک: غلظت بالای نمک در فاز متحرک می تواند در مراحل تحلیلی بعدی تداخل داشته باشد ، و این امر مستلزم روشهای اضافی آب نمک زدایی است.

پیشرفت های اخیر در HIC بر توسعه ماتریس های کروماتوگرافی جدید با راندمان و ثبات جداسازی پیشرفته متمرکز شده است. ترکیب اصول کروماتوگرافی تعامل آبگریز (HILIC) و استفاده از رزین های حالت مختلط ، کاربرد HIC را در جداسازی ترکیبات قطبی گسترش داده است.

علاوه بر این ، ادغام HIC با سایر تکنیک های کروماتوگرافی ، مانند کروماتوگرافی تبادل یونی یا کروماتوگرافی اندازه-انسداد ، توسعه پروتکل های تصفیه کارآمدتر و قوی تر را تسهیل کرده است. پیشرفت در اتوماسیون و فن آوری های غربالگری با توان بالا همچنین به مقیاس پذیری و تکرارپذیری فرآیندهای HIC کمک کرده است.

جهت های آینده در تحقیقات HIC شامل اکتشاف لیگاندهای جایگزین و ماتریس برای بهبود بیشتر راندمان جداسازی و گسترش دامنه برنامه ها است. توسعه مراحل موبایل سازگار با محیط زیست و پایدار و همچنین بهینه سازی شرایط شستشو برای به حداقل رساندن دناتوراسیون پروتئین ، مناطقی از تحقیقات مداوم باقی مانده است.

در نتیجه ، کروماتوگرافی تعامل آبگریز نشان دهنده ابزاری همه کاره و مؤثر برای جداسازی و تصفیه پروتئین ها ، به ویژه آنهایی است که دارای خاصیت آبگریز هستند. HIC با استفاده از فعل و انفعالات آبگریز دیفرانسیل بین مولکول های نمونه و فاز ثابت ، تصفیه پروتئین های با کیفیت بالا را برای کاربردهای مختلف درمانی ، تشخیصی و تحقیقاتی امکان پذیر می کند. با پیشرفت های مداوم در مواد کروماتوگرافی ، اتوماسیون و ادغام با سایر تکنیک ها ، آینده HIC نوید می دهد تا کارآیی بیشتری و کاربرد گسترده تری در زمینه بیو دارویی داشته باشد.

تگ های محبوب: کروماتوگرافی ستون آبگریز ، تولید کنندگان کروماتوگرافی ستون آبگریز چین ، تأمین کنندگان ، کارخانه